В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. метод применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Микробиологические исследования
Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя.
Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет.
Достоверность метода ПЦР
| ПЦР - что это такое простыми словами, преимущества ПЦР анализов | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. |
| ПЦР-анализ: метод диагностики, выявляемые инфекции | Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis. |
| Что такое ПЦР | Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. |
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. |
| Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности | Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. |
| Полимеразная цепная реакция — Википедия | Во-вторых, внедрение цифровизации ПЦР-диагностики увеличит пропускную способность лаборатории и поспособствует лавинообразному росту количества выполняемых анализов. |
| История открытия современных методов молекулярной диагностики | Исследования, проводимые одним из широко применяемых методов – методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются наиболее точными и достоверными. |
| Метод анализа ПЦР: суть и преимущества | Подготовка и проведение анализа ПЦР | Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. |
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Эти и другие открытия подготовили почву для того, чтобы в 1984 году Кэри Муллис предложил технологию, позволяющую специфически амплифицировать короткие ДНК-фрагменты в искусственных условиях — метод ПЦР. Хронологическая последовательность ключевых открытий, которые послужили основой для создания технологии ПЦР. Сегодня, когда метод ПЦР стал неотъемлемой составляющей как биологических наук, так и медицины, практически невозможно представить, что потребовалось немало времени, прежде чем эта методика заслужила внимание специалистов. Между тем, это было именно так! И на то было две основных причины. Ученому пришлось изрядно потрудиться, чтобы убедить руководителей в исключительных перспективах разработанного им метода. Во-вторых, ПЦР-технология в том виде, в котором она была предложена Кэри Муллисом, требовала доработки. Из-за этого полимеразу приходилось добавлять после каждого цикла, что существенно увеличивало как стоимость реактивов, так и времязатраты экспериментатора. Этот недостаток удалось преодолеть в 1986 году, когда Муллис и его научная группа решили использовать Taq-полимеразу, обладающую термоустойчивостью.
Были и другие трудности, но их все удалось преодолеть, и со временем ПЦР-технология заняла почетное место среди других успешно применяющихся технологий. Полимеразная цепная реакция: принцип работы Несмотря на революционное значение, принцип ПЦР основан на довольно базовых свойствах молекулы ДНК. Чтобы понять этот принцип, необходимо вспомнить, как устроена молекула ДНК и как осуществляется ее удвоение в клетке — репликация. ДНК представляет собой длинный полимер, состоящий из нуклеотидов — своего рода букв алфавита, — на котором записана вся генетическая информация о нашем организме. Только разных букв — нуклеотидов — в этом алфавите всего 4: аденин А , тимин Т , гуанин Г и цитозин Ц. Нуклеотиды в составе ДНК образуют две нити, которые комплементарно связаны между собой: нуклеотид А в одной цепи строго соответствует нуклеотиду Т в другой цепи, а Г соответствует Ц Рис. А: Строение молекулы ДНК. Б: Общая схема репликации ДНК в живой клетке.
Денатурация Самый первый этап — развернуть денатурировать нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки. Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР — способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов. Элонгация Или синтез.
После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот. Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле. В среду агар или полиакридный гель добавляют краситель ДНК например — бромистый этидий. В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием.
Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором флуорофором. После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор — детектор флюоресценции.
При бактериоскопическом методе анализ выполняется с помощью светового микроскопа. Исследуемый материал вносят в каплю физраствора, тщательно размешивают и распределяют по стеклу. Должно наступить хорошее окрашивание частей клеток и бактерий в разные цвета, чтобы оценить состав выделений из уретры, влагалища и шейки матки. Анализ соскоба из уретры или влагалища в гинекологии позволяет определить: - количество лейкоцитов их повышение говорит об инфекции, но у здоровых женщин небольшое число лейкоцитов присутствует во флоре ; - количество эритроцитов основной показатель воспалительного процесса при повышенном количестве ; -состав флоры у женщин он зависит от менструального цикла, но активность клеток говорит о нарушении микрофлоры ; - наличие трихомонады, гонококков, грибка — основная цель для выявления возбудителя инфекций; - наличие лактобацилл их отсутствие говорит о нарушенной микрофлоре.
Также мазок определяет степень чистоты влагалища женщины: 1 и 2 степень — характерна для здоровой флоры, а 3 и 4 — выявляет кольпит, воспаление. Преимущества данного метода состоят в простоте, доступности и быстроте получения результатов 30 - 60 мин и менее. Однако чувствительность данного метода ограничена около 105 бактерий в 1 мл. Практически не определяются в урогенитальном мазке вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, и одних только результатов мазка часто бывает недостаточно для постановки диагноза.
Хронологическая последовательность ключевых открытий, которые послужили основой для создания технологии ПЦР. Сегодня, когда метод ПЦР стал неотъемлемой составляющей как биологических наук, так и медицины, практически невозможно представить, что потребовалось немало времени, прежде чем эта методика заслужила внимание специалистов. Между тем, это было именно так! И на то было две основных причины.
Ученому пришлось изрядно потрудиться, чтобы убедить руководителей в исключительных перспективах разработанного им метода. Во-вторых, ПЦР-технология в том виде, в котором она была предложена Кэри Муллисом, требовала доработки. Из-за этого полимеразу приходилось добавлять после каждого цикла, что существенно увеличивало как стоимость реактивов, так и времязатраты экспериментатора. Этот недостаток удалось преодолеть в 1986 году, когда Муллис и его научная группа решили использовать Taq-полимеразу, обладающую термоустойчивостью. Были и другие трудности, но их все удалось преодолеть, и со временем ПЦР-технология заняла почетное место среди других успешно применяющихся технологий. Полимеразная цепная реакция: принцип работы Несмотря на революционное значение, принцип ПЦР основан на довольно базовых свойствах молекулы ДНК. Чтобы понять этот принцип, необходимо вспомнить, как устроена молекула ДНК и как осуществляется ее удвоение в клетке — репликация. ДНК представляет собой длинный полимер, состоящий из нуклеотидов — своего рода букв алфавита, — на котором записана вся генетическая информация о нашем организме.
Только разных букв — нуклеотидов — в этом алфавите всего 4: аденин А , тимин Т , гуанин Г и цитозин Ц. Нуклеотиды в составе ДНК образуют две нити, которые комплементарно связаны между собой: нуклеотид А в одной цепи строго соответствует нуклеотиду Т в другой цепи, а Г соответствует Ц Рис. А: Строение молекулы ДНК. Б: Общая схема репликации ДНК в живой клетке. В результате такого кодирования обе цепи ДНК несут одинаковую информацию, хоть и записанную разными буквами.
ПЦР-диагностика
Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты. Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций: Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться; В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений; Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней; За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек; Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти; За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур сауны, бани и т. Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.
Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких. Биологические жидкости — околоплодная, спинномозговая, суставная и т. Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса. Кровь, сыворотка, плазма. Их забирают методом биопсии. Преимущества и недостатки метода ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе — чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры — кусочки, из которых будут создаваться новые РНК.
Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической нижней фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной верхней фазе Рис. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками. Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени. Выделение на спин-колонках Рис. Схема протокола выделения на спин-колонках. Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё Рис. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца. Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено. Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты. Выделение на магнитных частицах Рис. Схема протокола выделения на магнитных частицах. Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 3. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др. К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют Рис. Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование например, центрифуга. Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца. Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие. Умное выделение Smart Extraction Рис. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena. Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry. Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества Рис. Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот. Ферментативное температурно-зависимое выделение Рис. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку. Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами. Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов. Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения от 7 минут и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов. Разрезание и сшивание ДНК Рестрикция и рестриктазы Разрезание ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах. Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную - целевую - последовательность нуклеотидов ДНК. Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так что, рестриктаза не может с ними работать Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности - для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз. Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует чем: длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину. Рисунок слева. Сайты рестрикции. Сверху — целевая последовательность рестриктазы SmaI, при работе которой образуются «тупые» концы. Снизу — целевая последовательность рестриктазы EcoRI, при работе которой образуются «липкие» концы. Итак, рестриктазы — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических и некоторых других организмах и выполняющие тем самым «иммунную» функцию — системы рестрикции-модификации. Для исследований их выделяют преимущественно из прокариотических клеток. Данные ферменты, «узнающие» определенные последовательности сайты рестрикции в двухцепочечной ДНК, расщепляют нуклеиновые кислоты в середине молекулы. Рестриктазы этого типа - узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. Также рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид последовательность из 4-х пар оснований и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Рестрикционный анализ ДНК Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Основные переменные параметры — это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны. Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. При помощи эндонуклеаз рестрикции можно исследовать ДНК различных вирусов, бактерий, животных, растений. Как правило, продукты расщепления ДНК анализируются с помощью гель-электрофореза в агарозном или акриламидном геле, а полученная таким образом картина разделения фрагментов ДНК в виде определенного, отличающегося для разных ферментов, набора полос и является результатом рестрикционного анализа той или иной ДНК. Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно вымывать в виде биологически активных двухцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами подробнее см. При использовании нескольких эндонуклеаз рестрикции на одном образце можно составлять рестрикционные карты. Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет оценить гомологию между ними. Анализируя рестрикционные карты, можно сравнивать определенные участки ДНК разных видов животных без определения их нуклеотидной последовательности. Таким образом, например, было установлено, что хромосомные участки, кодирующие цепи гемоглобина у человека, орангутанга и шимпанзе сохранились в практически неизменном виде в течение последних 5 - 10 млн. Метод рестрикционного картирования позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК. Рекомбинантный фермент выделен из штамма кишечной палочки E. Для улучшения результатов лигирования, общая рекомендация заключается в создании нескольких реакций с различными вставками: вектор молярных соотношений, как правило, в диапазоне от 1:1 до 5:1. Для менее эффективных лигирований, как и для фрагментов ДНК с тупыми концами, часто рекомендуется добавление инертных макромолекул, таких как полиэтиленгликоль ПЭГ , чтобы увеличить эффективную концентрацию компонентов реакции и тем самым повысить эффективность лигирования. Разделение молекул ДНК и белков Метод гель-электрофореза Электрофорез - это движение дисперсных частиц относительно жидкости под действием пространственно однородного электрического поля. Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться. Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза. ДНК помещают в гель обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду аноду , причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров смесей фрагментов ДНК известных длин можно установить длину молекул в образце Физический принцип метода заключается в следующем.
Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость. Стоит помнить, что возможность тестирования с помощью этого метода сейчас широко доступна. Сделать тест на коронавирус вы можете в нашей лаборатории. Мы также предлагаем сдать анализы крови, мочи и кала для правильной диагностики различных заболеваний. Другие статьи.
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
| ПЦР-тесты: для чего нужен, как сдавать анализ, цена, можно ли верить результатам | ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. |
| ПЦР - что это такое простыми словами, преимущества ПЦР анализов | метод применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека. |
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
FRT Manager позволяет получать и печатать результаты в формате лабораторного журнала, индивидуальных бланков для пациентов или выгружать все данные в ЛИС. Докладчик отметил, что это еще неполная автоматизация и цифровизация, так как она затрагивает только один из шагов — ПЦР-амплификацию. С одной стороны, он учитывает и автоматизирует техническую составляющую лаборатории — методы экстракции, имеющееся оборудование, используемые наборы реагентов. С другой стороны, программа держит в своих настройках тип биоматериала и направления на исследования, на основе чего составляет и выдает рабочее задание для персонала и оборудования.
Когда образцы поступают в лабораторию, с них сканером штрих-кодов считываются данные, обрабатываются, и на этап экстракции формируется задание для сотрудников. Они устанавливают часть проб в станции выделения, а с другими работают вручную. После экстракции генерируется задание для амплификаторов, сотрудник загружает планшеты или пробирки и запускает прибор.
ПЦР иногда используется также при установлении отцовства[7]. Преимущества и недостатки подхода Какие плюсы у диагностики методом ПЦР? Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а также в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекает латентно.
Для проведения ПЦР-анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи. Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни. Результат, как правило, готов через пять—семь часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.
Метод ПЦР практически не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа[8]. Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов.
Работа с малым количеством ДНК материала. Мы уже успели привыкнуть к тому, что можно быстро и недорого определить причину недомогания, сделать генетический анализ. Но это стало возможно не так давно. Столь резкий прогресс в медицинской диагностике во многом обязан одной технологии, а именно — полимеразной цепной реакции. За время эпидемии коронавируса вы почти наверняка сталкивались с ее аббревиатурой — ПЦР. Чтобы доказать, что вы здоровы, нужно было сделать «ПЦР-тест», подтверждающий отсутствие в организме коронавирусного генетического материала. Именно об этой технологии мы и расскажем в нашей статье.
Кэри Муллис: создатель технологии ПЦР. Ниже мы кратко резюмируем суть и значение наиболее важных для возникновения ПЦР работ см. В 1953 году исследователи Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали работу 2 , которая внесла существенный вклад в понимание структуры ДНК — молекулы, в которой зашифрована уникальная для каждого организма генетическая информация. Именно эта информация является ключом как к определению вида организма, что необходимо для детектирования патогена, так и к выявлению генетических особенностей и заболеваний человека методом ПЦР. В 1950-х гг. Артур Корнберг изучал механизмы репликации, или самоудвоения, ДНК. Ему же удалось впервые осуществить синтез ДНК вне живой клетки, в пробирке. А в 1957 ученый вместе со своей научной группой выделил из бактерии Escherichia coli первую ДНК-полимеразу 3 — ключевой фермент, обеспечивающий синтез ДНК. В 1960-х Хар Гобинд Корана продолжил изучение механизмов синтеза нуклеиновых кислот. В частности, в его лаборатории впервые синтезировали целый ген.
В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты. Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций: Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться; В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений; Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней; За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек; Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти; За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур сауны, бани и т. Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.
Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве.
Принципы ПЦР-диагностики
Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4]. Исследования, проводимые одним из широко применяемых методов – методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются наиболее точными и достоверными.
Чем отличается диагностика ПЦР от ИФА
Эффективность этиологической диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих инфекционных агентов: Rotavirus, Astrovirus, Norovirus и бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Y. Классические микробиологические методы посевы и культивирование на культурах клеток не обладают необходимой скоростью диагностики и не удовлетворяют потребности Роспотребнадзора при расследовании случаев групповой заболеваемости, но являются единственными видами исследований, при которых можно выделить и накопить «чистую культуру» возбудителя для дальнейшего использования в научно-практической деятельности. Метод полимеразной цепной реакции предусматривает работу с любым генетическим материалом без подразделения по микробиологическим направлениям, что дает возможность организации централизованной ПЦР-лаборатории как отдельного структурного подразделения по различным направлениям деятельности. Первые исследования проводились с элетрофоретической детекцией продуктов амплификации.
ПЦР полимеразная цепная реакция — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. Он основан на многократном копировании амплификации определенных участков вирусной ДНК в лабораторных условиях. По факту, чтобы «засечь» вирус в организме, с помощью специального фермента, собирающего из нуклеотидов по образцу вирусной ДНК ее копию, ученые дублируют фрагменты генетического материала вируса, пока их число не станет настолько большим, что будет возможно зафиксировать его присутствие с помощью флуоресцентных меток. Как это работает? Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК. РНК-праймер изображен белым прямоугольником в начале каждой из двух цепей Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный.
По завершении реакции цикл неоднократно повторяется см. Общая схема полимераной цепной реакции. Цифрами обозначены ее этапы. В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК а это коронавирусы, или, например, ВИЧ , ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше. Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса. Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х. Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах Thermal cycler.
Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.
Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно.
Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования. Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации.
Все приборы должны соответствовать нормам безопасности. Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3]. Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов.
Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок центрифужных, градуированных и пр. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач. Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].
Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб. Обозначения: 1 — зона приема, разбора и первичной обработки материала; 2 — зона подготовки проб и выделения НК; 3 — зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР; 4 — зона детекции результатов методом электрофореза и ГиФА; 5 — комната анализа результатов; 7 — комната обеззараживания материала. В последней, но немаловажной зоне дезинфекции материалов необходим паровой стерилизатор для обработки образцов водяным паром под давлением. Состав оборудования может варьировать в зависимости от размера лаборатории и других факторов.
Заключение Метод ПЦР находит применение в различных областях диагностики. Его применяют для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, а также для обнаружения приобретенных и врожденных генетических нарушений и идентификации личности [5]. Автоматизация этапов денатурации, отжига и элонгации с применением современного оборудования позволяет упростить проведение анализа и способствует его широкому применению в различных областях диагностики. Однако повсеместное внедрение данного метода ограничивается необходимостью ручной и трудоемкой подготовки проб идетекции результатов, а также необходимостью в оснащенной лаборатории со всеми необходимыми реактивами и оборудованием.
Сфера применения полимеразной цепной реакции в дальнейшем будет расширяться, так как все чаще в клинической практике имеют дело с очень небольшим количеством исследуемого материала, анализ которого возможен только этим методом. Появление все новых видов ПЦР способствует охвату большего спектра возможностей для применения метода, упрощает и ускоряет его проведение, тем самым позволяя получить наиболее точный, верный и быстрый результат. Библиографическая ссылка Колотова А. Педагогические науки.
Они устанавливают часть проб в станции выделения, а с другими работают вручную. После экстракции генерируется задание для амплификаторов, сотрудник загружает планшеты или пробирки и запускает прибор. После окончания амплификации выдаются результаты, которые уже проанализированы, а задача сотрудников — удостовериться в отсутствии ошибок. Вся информация уходит на сервер. Она может остаться на хранении, поступить в ЛИС, или же ее можно напечатать в лабораторный журнал и разослать в кабинеты врачей. В заключение Максим Ионов отметил, что разработанные программные решения позволяют обеспечить поток информации на всех этапах работы, от сортировки образцов до выдачи результатов. Внедрение информационных и цифровых технологий вместе с аппаратными компонентами делает отечественные лаборатории готовыми к любым эпидемиологическим неожиданностям.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
ПЦР получила широкое распространение в различных областях практической медицины. Исследование является одним из основных методов диагностики различных инфекционных заболеваний с половым путем передачи. К ним относятся патологические процессы, вызванные: вирусами герпетическая, папилломавирусная инфекция , ВИЧ СПИД, вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи специфическими бактериями сифилис, гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз простейшими трихомониаз Полимеразная цепная реакция также может использоваться для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенными грибами кандидоз. Какой материал исследуется?
Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека.
Универсальный метод молекулярно-генетической диагностики полимеразная цепная реакция - перспективы и будущее в системе Роспотребнадзора 30. Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Этот метод позволяет выделить в исследуемом материале уникальный участок генетической информации любого организма. В настоящее время ПЦР широко применяется в следующих отраслях: в генетических исследованиях, диагностике инфекционных заболеваний, для определения ГМО в продуктах питания, в ветеринарии, растениеводстве и судебно-медицинской экспертизе, позволяя производить разнопрофильные исследования на минимальном оборудовании, с привлечением меньшего количества квалифицированного персонала по сравнению с другими методами.
Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются В исследовании обычно используются различные биоматериалы: — Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса. Их забирают методом биопсии. Преимущества и недостатки метода ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно.
Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме». По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала: «Самый первый недостаток метода — необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать.
Вызывает образование на коже и внутренних органах хорошо знакомых многим наростов. В самом простом случае, речь идет о бородавках. Но существуют и другие аномальные структуры. Например, невус родинка , остроконечная кондилома. Последние образуются на репродуктивных органах и в области заднего прохода, передаются половым путем. Многие штаммы вируса папилломы человека а известно их более 150 потенциально онкогенны. Способны спровоцировать рак. Потому ПЦР незаменима при ранней диагностике и разработке индивидуальных мер профилактики, лечения.
Герпес Любого типа. Известно более 6-и штаммов этого вируса. Первый провоцирует образование папул в полости рта и на губах. Второй — транспортируется половым путем и плохо поддается коррекции. Третий — это вирус Варицелла-Зостер, которые вызывает ветряную оспу. Четвертый становится виновником мононуклеоза. Пятый — цитомегалии. Шестой влияет на работу головного мозга.
Так можно продолжать и далее. Суть в том, что с помощью ПЦР удается выявить сам герпес и его штамм, определить характер и давность поражения, патологического процесса. В этом суть диагностики. Гепатит Воспаление печени. Полимеразная цепная реакция назначается не только для определения самого факта расстройства. Суть в другом. ПЦР диагностика инфекций дает возможность дифференцировать септические и токсические, прочие формы гепатита, определить конкретный штамм вируса, который спровоцировал патологический процесс. Кандидоз Молочница.
Вызывается грибком с идентичным названием. Поражает слизистые оболочки. В том числе полость рта, половые органы женщины реже — мужчины. Вызывает массу осложнений и дискомфортных ощущений. ПЦР тест назначается в качестве верифицируемого, подтверждающего догадки метода, исследуется параллельно с данными анамнеза, визуальной оценки, симптоматики. Хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз и прочие венерические инфекции. На ранних стадиях патологического процесса есть риск не заметить симптомы. Но именно этот момент — лучший для терапии.
Поскольку дальше начинаются необратимые изменения в органах и системах. Болезнь не удается взять под контроль, обеспечить продолжительную жизнь пациенту также невозможно. ПЦР назначается для раннего выявления патологического процесса.
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе.
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. Метод ПЦР позволяет выявить наличие определенной ДНК последовательности с мутацией и подтвердить диагноз.