Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале. О сервисе Прессе Авторские права Связаться с нами Авторам Рекламодателям Разработчикам.
Микробиологические исследования
Секвенирование нового поколения NGS Наиболее информативным методом молекулярно-генетической диагностики в клинической онкологии является секвенирование нового поколения NGS. Эта методика предусматривает секвенирование разделение молекулы ДНК конкретного человека на отдельные гены с последующим рассмотрением и фиксацией найденных отклонений от нормального строения каждого гена из интересующего списка панели генов. Какой лучше: достоинства и недостатки разных методов молекулярной диагностики Среди современных видов молекулярной генетической диагностики в онкологии наибольшее применение имеют ПЦР полимеразно-цепная реакция и секвенирование нового поколения NGS, next generation sequencing , которые практически вытеснили из клинической практики ранее имевшее широкое применение секвенирование по Сэнгеру. Остальные методы либо уступают по информативности и точности получаемых данных, либо используются исключительно в научной деятельности из-за высокой стоимости тестирования. Отдельно следует упомянуть цитогенетический метод FISH флуоресцентная гибридизация in situ. Так называемый FISH-тест выполняется для подтверждения предположений клинического онколога о наличии специфических мутаций в определенных генах и служит для избрания оптимальной тактики лечения. Однако более корректно отнести FISH к разделу морфологических исследований, так как основой метода является микроскопическая визуализация процесса взаимодействия компонентов во время исследования. В таком случае любые заключения являются субъективными и зависят от квалификации специалистов, выполняющих диагностику. Кроме того, некорректно сравнивать FISH-тест с другими видами генетической диагностики - часто FISH имеет специфическое применение в качестве единственного возможного метода диагностики, например, при таких заболеваниях, как миелолейкоз, лейкоз, хронический лимфолейкоз и др. NGS секвенирование нового поколения Позволяет рассмотреть все мутации в заданном списке генов в рамках одного исследования исследование панели генов , давая полную картину имеющихся мутаций, что позволяет избежать дополнительного тестирования.
Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии примерно 30 генов , методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней. Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов. С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства.
Для взятия мазка или соскоба используются зонды с разными наконечниками; Кровь из вены берут, когда нужно обнаружить ВИЧ, гепатит, цитомегаловирус, мононуклеоз или какое-либо заболевание бактериальной этиологии, например, сифилис, холеру или боррелиоз; Биологические жидкости моча, слюна, сперма, мокрота, секрет предстательной железы, желудочный сок, плевральная, суставная, спинномозговая или амниотическая жидкость, а также бронхоальвеолярный лаваж берутся по показаниям.
Например, ПЦР-анализ мокроты используется при диагностике туберкулёза; Пунктаты и биоптаты органов и тканей, как правило, берутся при подозрении на онкологию. Исключение составляет биопсия желудка, которую проводят для определения наличия Helicobacter pylori — бактерии, вызывающей гастрит и язвенную болезнь. Хранение и транспортировка биоматериалов Пробы подлежат отправке в амплификатор не позднее, чем через 2 часа после забора, если они находятся в помещении при комнатной температуре. После оттаивания они должны быть сразу использованы, повторное замораживание запрещено. В подавляющем большинстве случаев ПЦР-диагностика проводится «день в день»: пациент приходит в клинику, где у него берут мазок или кровь и сразу отправляют биоматериал в лабораторию, поэтому беспокоиться о правилах хранения не стоит.
Как подготовиться к ПЦР-диагностике? Правила довольно просты: Мазок или соскоб из половых путей, как у мужчин, так и у женщин, сдается после 72-часового воздержания от сексуальных контактов, непосредственно перед забором нужно произвести туалет интимной зоны и 2-3 часа не мочиться. Прекрасной половине человечества не следует планировать визит в лабораторию во время менструации и сразу после неё, кроме того, запрещено использовать какие-либо средства, нарушающие естественное состояние микрофлоры влагалища спринцевания, свечи. Всем пациентам необходимо завершить антибактериальную терапию если таковая проводилась не позднее, чем за 2 недели до ПЦР-анализа; Кровь сдается из вены утром натощак; Мочу и сперму собирают в маленькие стерильные контейнеры, которые можно приобрести в аптеке, если процедура забора будет производиться дома. Но не забывайте о сроках хранения и транспортировки биоматериалов — максимум 2 часа; Слюну собирают после 3 часов воздержания от приёма пищи и напитков, допустимо только полоскать рот водой.
Непосредственно перед забором рекомендуется помассировать область слюнных желёз. Прочие, редко используемые виды биоматериалов собирают только в клинике, где вам и предоставят все необходимые пояснения относительно подготовки. Результаты ПЦР-анализа Выше мы упоминали о качественной и количественной ПЦР-диагностике, так вот, в первом случае расшифровка результатов не представляет никакой трудности: ответ либо положительный, либо отрицательный. И если условия подготовки, сбора биоматериала, проведения анализа и оценки итогов не были нарушены, то нет и причин сомневаться в достоверности полученных данных. По-другому дело обстоит в случае с ПЦР количественной.
Её результатом является число, демонстрирующее вирусную нагрузку.
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.
Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты.
Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР.
ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика. Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу. Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления. Если построить график увеличения вещества, синтезированного в начале ПЦР, мы получим на полулогарифмическом графике прямую линию, показывающую, что объем продукта удваивается с каждым циклом. Количество циклов, требуемых для достижения некоего произвольного порога, зависит от того, сколько шаблона первоначально присутствовало в начале ПЦР: чем меньше циклов необходимо для достижения данного порога, тем больше шаблона, по-видимому, присутствовало вначале. Важно, чтобы эффективность амплификации образца А и образца Б были сравнимыми, то есть два прямых сегмента на графике должны быть параллельными.
Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований
Что такое ПЦР, как работает метод ПЦР в диагностике, преимущества методики, показания, подготовка к проведению ПЦР-анализа, как проводится ПЦР-анализ, что показывают результата теста. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4]. К неоспоримым преимуществам метода полимеразной цепной реакции относятся следующие аспекты.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Для получения антител первоначально использовали иммунизацию животных обычно кролика очищенным белком. Однако в этом случае получали смесь антител к разным антигенным детерминантам молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлонильным препаратом. Использование поликлональных антител имело два существенных недостатка: 1 содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2 поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различать сходные мишени, то есть когда патогенная мишень и непатогенная не-мишень формы различаются единственной детерминантой. Этим объясняются многочисленные «перекрестные» положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам. Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку.
Это стоит немалых денег. Благодаря разработке метода получения моноклональных антител МАТ с помощью техники гибридом стало возможно получение препаратов антител к одной антигенной детерминанте. Мильштейн и Г. Келер за разработку техники получения гибридом, вырабатывающих МАТ с запрограммированной специфичностью, получили в 1984 году Нобелевскую премию в области медицины и физиологии. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму.
В основу метода положен давно известный принцип гибридизации слияния соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов. Первые — плазмоцитомы опухолевые плазмоциты из линий, культивируемых в искусственных условиях, invitro. Как и все злокачественные клетки они интенсивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки —иммунные лимфоциты.
Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней. Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих «родителей». К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т. Преимущества МАТ: Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность против одной антигенной детерминанты и абсолютная однородность.
Возможность многократного получения в течение длительного времени воспроизводимость. Неограниченное количество получаемых антител. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. Метод ИФА находится в постоянном развитии.
С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.
Если отслеживаете показатели в динамике, сдавайте каждый анализ при одинаковых условиях: в том же лабораторном отделении, тем же методом. Исследования для оценки эффективности лечения, как правило, проводят через 2—4 недели после приёма антибактериальных препаратов. Подготовка к ПЦР-анализу слюны За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами. За 3 часа до исследования рекомендуется отказаться от курения, употребления пищи и гигиены полости рта полоскание, чистка зубов, применение освежителей для рта, употребление леденцов, жевательной резинки. Подготовка к ПЦР-анализу мокроты За 2 недели до исследования по согласованию с лечащим врачом следует прекратить приём противомикробных препаратов и иммуномодуляторов.
Мокроту следует собирать утром, сразу после пробуждения. Предварительно нужно почистить зубы и прополоскать рот, нельзя есть до взятия биоматериала. Важно собирать не слюну или носоглоточную слизь, а мокроту. Сделайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать «мокрый» кашель. Необходимо откашлять содержимое глубоких дыхательных путей. Сплюньте мокроту в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Минимальный объём мокроты — 1 мл. Доставьте контейнер в лабораторное отделение в день взятия биоматериала.
При наличии инфекции в организме контакт биоматериала с реактивом приводит к окрашиванию контрольной полоски. Результат появляется через 20-30 минут. Наибольшую точность тест показывает в первую неделю после заражения. В дальнейшем повышается вероятность получения ложноотрицательного результата. Для уточнения диагноза лучше сделать ПЦР-тест. Анализ на антитела к коронавирусу Анализ на антитела к коронавирусу показывает не присутствие инфекции в организме, а ответ иммунной системы на нее. В ответ на заражение она вырабатывает несколько типов иммуноглобулинов: IgA являются реакцией непосредственно на коронавирус; IgM синтезируются при наличии инфекции в организме указывают на острое течение заболевания ; IgG появляются, когда тело «запоминает» вирус и формирует иммунитет к нему. Недостаточно, чтобы антитела были просто выявлены. Нужно смотреть и на их комбинацию. Сдать такой анализ нужно, чтобы узнать, вырабатывает ли организм антитела к вирусу, а если да, то сколько. Тесты на антитела Разные виды тестов на антитела к коронавирусу проводятся дома или в лаборатории. В лаборатории берут кровь из вены и выполняют количественную оценку вырабатываемых иммуноглобулинов. Домашний тест покажет, есть ли антитела в принципе. Сколько их вырабатывается, с его помощью узнать нельзя: для этого требуются познания в биохимии и специальное оборудование для подсчета. В этом случае достаточно капиллярной крови из пальца. Проколоть себе палец может не каждый, поэтому стоит прибегнуть к помощи близких или вызвать медсестру. Анализ сдают натощак. Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно.
Полимеразно-цепная реакция основана на обнаружении специфической ДНК или РНК бактерий либо вируса в присутствии миллионов других молекул. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы имеет огромное значение для эффективного лечения и предотвращения распространения инфекции. Принцип действия ПЦР состоит в многократном синтезе копий генетического материала вирусов или бактерий в лабораторных условиях. Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота. ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований — нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладают свойством комплиментарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида. Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином. Но не наоборот. В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте —РНК. Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму. Упрощенно такой механизм идентификации можно сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека. Нет необходимости видеть портрет. Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных.
Диагностика COVID-19: обзор основных методов
Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов. Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях. Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток. Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции. Необходимо строго соблюдать правила сбора биоматериала и его хранения. Важно выбрать правильное время взятия биоматериала и выполнить правила подготовки к тесту. В частности, это касается и нового коронавируса, который присутствует в выделениях носоглотки и ротоглотки только в течение определенного времени, по истечении которого анализ окажется отрицательным. Кроме того, высокая чувствительность ПЦР может иногда превращаться из преимущества в недостаток.
Показания к проведению ПЦР-анализа ПЦР-тесты используются для: диагностики инфекционных заболеваний, вызванных вирусами, бактериями и грибами, в том числе для определения возбудителей ряда урогенитальных инфекций; определения патологических генетических нарушений; определения роста и развития раковых клеток.
Тем не менее почти половина! Конечно, ранее в условиях внезапной пандемии и нехватки времени, это можно было оправдать. Однако теперь, спустя месяцы, появились современные тест-системы с РНК в качестве ВКО и, естественно, предпочтительнее использовать их. Некоторые разработчики пошли еще дальше. Пастера приложили все усилия, чтобы разработать тест-систему по всем правилам и мировым стандартам ПЦР-диагностики. Фаг, в свою очередь, защищает РНК от разрушения при взаимодействии с клиническим образцом, тем самым получается препарат армированной защищенной РНК коронавирусной инфекции. Попросите инструкцию, прочитайте, не все так сложно.
Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса. Наличие антител и прививки Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения. Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев. Однако присутствие иммуноглобулинов не отменяет необходимость вакцинации. Вопреки распространенному мифу, перед прививкой выяснять их количество не нужно. Дополнительная диагностика Перечисленные методы диагностики позволяют установить наличие в организме COVID-19 и иммунный ответ на него. Однако у разных людей заболевание протекает неодинаково: меняется набор симптомов, риски возникновения тех или иных осложнений. Если у выздоровевшего пациента обнаружены антитела в достаточном количестве, это позволяет ему стать донором крови для лечения тяжелых больных. Для этого ему нужно пройти стандартную диагностику во избежание передачи иных вирусов реципиентам. Коротко обо всех методах диагностики коронавируса Мы рассмотрели возможные методы обнаружения коронавируса в организме, оценки его устойчивости к данному заболеванию. Подчеркнем, что наличие вируса и выявленные антитела к нему — не одно и то же, поэтому и показания к прохождению обследований отличаются. При появлении первых признаков ОРВИ, которую легко перепутать с коронавирусом, лучше сразу выбрать полимеразную цепную реакцию. На этом этапе важно выяснить, имеет место банальная простуда или более опасное заболевание. Иммуноглобулинов на первых этапах вообще не бывает, так что искать их нет смысла.
Применение полимеразной цепной реакции в диагностике инфекционных заболеваний Владимир Анатольевич Климов кандидат медицинских наук, руководитель службы организации медицинской помощи, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства. Кулакова» Минздрава России, Klimov12008 rambler. Ученые умы постоянно предпринимали попытки внедрения новейших методик, и если в XX веке было достигнуто понимание протекания различных процессов на клеточном уровне, то на новейшем этапе развития наблюдается переход уже на изучение молекулярного и даже атомного состава отдельно взятых производных, что должно способствовать переходу на качественно новый уровень понимания процессов. Первым о нанотехнологиях заговорил Ричард Филипс Фейнман, который еще в 1959 г. На современном этапе нанотехнологии всё активнее внедряются в медицинскую науку, в частности в сферу лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Совсем недавно этот факт получил практическое подтверждение на примере организации масштабного тестирования населения на наличие коронавирусной инфекции. Методы, используемые на базе атомно-силовых молекулярных детекторов, предоставляют уникальную возможность визуализации и идентификации белковых маркеров патологических процессов и состояний с чувствительностью, на несколько порядков превышающей таковую при стандартных лабораторных исследованиях. Этот принцип и был положен в основу реализации метода полимеразной цепной реакции, сущность которой заключается в многократном преумножении микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом наблюдается копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует специалиста на данный момент. Цикл образования новой молекулы ДНК занимает порядка трех минут, при этом 30—40 циклов оказывается вполне достаточно для получения должного количества молекул, необходимого для достоверного визуального определения искомого агента методом электрофореза. Литература: 1. Высотин С. Гильмиярова Ф. Полимеразная цепная реакция. История открытия. Лопухов Л.
Принципы ПЦР-диагностики
В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к. Гордиев М.
Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность.
Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?
Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки секвенирования ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций. В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома.
Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли.
Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Асимметричная ПЦР англ. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Групп-специфическая ПЦР англ. Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Какие биологические материалы исследуются? Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза.
Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон. Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек.
Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу. Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления. Если построить график увеличения вещества, синтезированного в начале ПЦР, мы получим на полулогарифмическом графике прямую линию, показывающую, что объем продукта удваивается с каждым циклом. Количество циклов, требуемых для достижения некоего произвольного порога, зависит от того, сколько шаблона первоначально присутствовало в начале ПЦР: чем меньше циклов необходимо для достижения данного порога, тем больше шаблона, по-видимому, присутствовало вначале. Важно, чтобы эффективность амплификации образца А и образца Б были сравнимыми, то есть два прямых сегмента на графике должны быть параллельными.
Дата обновления публикации: 18.
Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной. Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 - 95 градусов, цепочки разъединяются...
Обычно за 1 - 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально. Схематично, это выглядит так: Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию денатурация происходит так называемое раскручивание ДНК — то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую отжиг - происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, "фермент-строитель" достраивает нити, восстанавливая ДНК.
В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения амплификаций определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить "на поток" метод помогли специальные автоматические термостаты - амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор — сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла.
В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки. Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки зонды. Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула флуорофор , а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю.
При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует. Дальше всё происходит, так же, как было описано выше: В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки. Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.
Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке.
ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Как проводится ПЦР-диагностика, когда назначают исследование с помощью этого метода и как подготовиться к анализу. Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце. Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.).
Достоверность метода ПЦР
| Актуальные методы диагностики COVID-19 | Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. |
| Отечественные решения для автоматизации и цифровизации ПЦР-исследований — PCR News | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). |
Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО)
• При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах.
ПЦР анализ: что это такое?
Детекция - заключительный этап в постановке ПЦР. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Метод электрофореза основан на разделении фрагментов ДНК ампликонов в агарозном геле в соответствии с их зарядом и линейными размерами с ультрафиолетовой детекцией при окрашивании бромистым эти-дием. Этот метод позволяет осуществлять только качественный анализ и имеет ряд ограничений и недостатков: большие затраты времени на стадию детекции; невозможность автоматизации; сложность и субъективность трактовки результатов; высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение; повышенные требования к организации лаборатории; максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР; выделение отдельного сотрудника на стадию детекции; постоянный контроль смывов. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации.
Москва, ул. Касаткина, За тел. Новгород, ул. Невзоровым д.
Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность. Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?
Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки секвенирования ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций. В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома. Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли. Именно поэтому услуги молекулярно-генетической лаборатории МИБС востребованы онкологами по всей РФ - с конца 2021 года образцы для выполнения исследования можно передать в любом из региональных центров МИБС либо отправить курьерской службой для получения подробной информации о логистике образцов, обратитесь любым из доступных на сайте способов.
К тому же большинство исследований, связанных с определением эффективности лечения, могут быть выполнены в нашей лаборатории за счет ОМС , независимо от региона проживания гражданина РФ. Комплексное геномное профилирование КГП определяет уникальный молекулярный профиль опухоли, изучая список из 324 генов, значимых с точки зрения лечения онкологических заболеваний. Тест выполняется в рамках одного биоматериала парафиновые блоки образцов опухоли либо образец крови, в зависимости от заболевания во внешней лаборатории Foundation Medicine Пензбург, Германия. Результаты КГП позволяют оптимизировать проводимую противоопухолевую терапию у детей и взрослых, назначив персонализированное таргетное лечение при любых солидных опухолях, гемобластозах, саркомах.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин. Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой.
Если при копировании участка ДНК в нем продолжает появляться вирус, значит, пациент заражен. Получить результаты ПЦР-теста можно через несколько дней. Во время ожидания особенно при наличии симптомов лучше соблюдать самоизоляцию. Сегодня это наиболее достоверный диагностический метод. Риск получения ошибочного результата Вероятность получения ложноположительного результата невелика. Вирус может попасть в биоматериал пациента извне при условии нарушения санитарных правил. Поэтому проходить обследование лучше в надежных лабораториях, где подобное исключено. Ложноотрицательные результаты встречаются чаще. Во избежание их получения перед забором биоматериала нельзя курить и дезинфицировать носоглотку антисептиками. Исказить клиническую картину также могут: ошибки медработника при взятии мазка; забор материала на поздней стадии, когда концентрация вируса минимальна; отсутствие микроорганизмов в носоглотке. Последнее возможно, если коронавируса там не было изначально попал в организм иным путем, например, через кровь. Бывает, что в носоглотке возбудитель не оседает, а сразу продвигается в легкие и выявляется только на компьютерной томографии. Экспресс-тест на коронавирус Экспресс-тест можно сделать в домашних условиях. Он не предполагает лабораторных исследований, не требует специального оборудования. Достаточно купить набор в аптеке. Например, к Standard Q Covid-19 прилагается подробная инструкция. Для проведения экспресс-теста на коронавирус понадобятся: стерильный тампон человек берет у себя мазок сам ; одноразовая кассета в индивидуальной упаковке; пробирка с реактивом; насадка с капельницей. При наличии инфекции в организме контакт биоматериала с реактивом приводит к окрашиванию контрольной полоски. Результат появляется через 20-30 минут. Наибольшую точность тест показывает в первую неделю после заражения. В дальнейшем повышается вероятность получения ложноотрицательного результата. Для уточнения диагноза лучше сделать ПЦР-тест.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных резуль-татов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяй-ствах. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.
Что такое анализ ПЦР?
| Микробиологические исследования | Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в об-ласти молекулярной биологии за последние десятилетия. |
| ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится? | Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен | В Роспотребнадзоре разъяснили, чем отличается тестирование на коронавирус методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) от экспресс-теста. |
| Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен | Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК. |