Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем. 6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки. ПЦР с анализом результатов по конечной точке (End-point PCR) – это модифика-ция метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуо-ресценции после амплификации.
Что такое ПЦР анализ
Рисунок 1. Схема трех стадий полимеразной цепной реакции. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте — РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР. Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий. Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко. Достоинства Теория — это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР? Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальность метода.
Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем. Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа. Метод обладает высочайшей чувствительностью — мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
В 1952 г. Херши и М.
Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее. В 1949—1951 гг. Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК. Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж.
Уотсоном и Ф. Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями аденин-тимин и гуанин-цитозин. В 1955 г. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК матрицей по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты дНТФ , которые используются в качестве «строительного материала». В 1971 г.
Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако, из-за технологической сложности искусственного синтеза праймеров и нестабильности реакции, метод ПЦР было невозможно использовать на практике в полной мере. В 1975 г. Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию. А в 1976 г. В 1983—1984 гг.
Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.
Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР».
Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться. Чего «боится» ПЦР, что она умеет и как к ней подготовиться? Как в любых других исследованиях, иной раз результаты теста оказываются ложноположительными или ложноотрицательными, где ПЦР исключением не является. Подобное может происходить в случаях: Нарушения технологического процесса на одном из этапов реакции; Несоблюдения правил забора материала, его хранения или транспортировки; Присутствие посторонних примесей в материале. Это говорит о том, что к ПЦР — диагностике инфекций нужно подходить внимательно, осторожно и аккуратно, иначе образцы материала могут поменять свое структурное строение или вовсе разрушиться. Этапы ПЦР-диагностики.
Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой: Туберкулез различной локализации, пневмония в том числе и атипичная, вызванная хламидией ; Детские инфекции коревая краснуха, паротит, корь ; Дифтерия; Зоонозная инфекционная болезнь — листериоз заболевание характеризуется многообразием симптомов с поражением лимфоузлов, ЦНС, внутренних органов ; Заболевания, обусловленные проникновением вируса Эпштейн-Барра инфекционный мононуклеоз и др. Доказано, что хеликобактер становится причиной развития рака желудка или 12-перстной кишки; Кандидоз и практически все ЗППП. ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка. Некоторые из них «торч» относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи.
Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы. Анализируемый образец — вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется. Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты. Внутренние контроли — несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке. ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера около 30 нуклеотидов , комплементарные специфическим ампликонам продуктам реакции. Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу. Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами. Ход реакции Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1]. Денатурация — процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур. Отжиг — процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются. Элонгация синтез. Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом hot-start PCR — суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров. ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования.
Диагностика ВИЧ: методы и исследования
К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования: Моча сдается утром в стерильный контейнер. Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время. Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа. Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день. Расшифровка анализа ПРЦ Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой. Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала.
В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать: Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель. В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве. Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.
Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК.
То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Один цикл длится 2-3 минуты. Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа. Этап идентификации размноженного генетического материала Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т. При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген краситель , вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе.
На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР.
Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Какие биологические материалы исследуются? Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб. Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный одноразовый флакон. Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем ЗППП , таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции. Кровь, плазма, сыворотка. Как подготовиться к сдаче анализа?
Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела?
Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса.
Наличие антител и прививки Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения. Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев. Однако присутствие иммуноглобулинов не отменяет необходимость вакцинации. Вопреки распространенному мифу, перед прививкой выяснять их количество не нужно. Дополнительная диагностика Перечисленные методы диагностики позволяют установить наличие в организме COVID-19 и иммунный ответ на него.
Однако у разных людей заболевание протекает неодинаково: меняется набор симптомов, риски возникновения тех или иных осложнений. Если у выздоровевшего пациента обнаружены антитела в достаточном количестве, это позволяет ему стать донором крови для лечения тяжелых больных. Для этого ему нужно пройти стандартную диагностику во избежание передачи иных вирусов реципиентам. Коротко обо всех методах диагностики коронавируса Мы рассмотрели возможные методы обнаружения коронавируса в организме, оценки его устойчивости к данному заболеванию. Подчеркнем, что наличие вируса и выявленные антитела к нему — не одно и то же, поэтому и показания к прохождению обследований отличаются. При появлении первых признаков ОРВИ, которую легко перепутать с коронавирусом, лучше сразу выбрать полимеразную цепную реакцию.
На этом этапе важно выяснить, имеет место банальная простуда или более опасное заболевание.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
| Микробиологические исследования | Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4]. |
| Принципы ПЦР-диагностики. Реферат. Медицина, физкультура, здравоохранение. 2013-05-03 | Специфическое обследование на SARS-CoV-2 делают двумя способами: методом ПЦР и посредством экспресс-тестирования. |
Что такое ПЦР анализ
Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории ПЦР полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция - это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР. В первую очередь, это недостаточная информативность - один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог. В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК. Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами: ПЦР исследование - позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов к. Гордиев М.
Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога. Секвенирование по Сэнгеру С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера - низкая чувствительность. Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов как следствие - пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным. Учитывая развитие и доступность в России в том числе по ОМС в МИБС более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии. При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?
И при расчете результатов сотрудники лаборатории могут определить, присутствуют ли в исследуемом образце определенные бактерии и вирусы, поэтому результаты анализа в основном качественные. Метод ПЦР строго специфичен и при правильном выполнении не может дать ложноположительного результата. То есть, если инфекции нет, анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому очень часто ПЦР-анализ проводится дополнительно для подтверждения диагноза, а также для того, чтобы определить патоген и его природу. Преимущества и недостатки На сегодняшний день ПЦР считается наиболее информативным способом определения возбудителей инфекционных заболеваний. Диагностика с помощью этого метода позволяет найти возбудителя, присутствующего в исследуемых материалах. Это — наиболее точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции и другие заболевания, передающиеся половым путем. Кроме этого, с помощью ПЦР сегодня определяется наличие коронавируса и ряда других инфекционных болезней, которые передаются воздушно-капельным путем. Полимеразная цепная реакция является эффективным диагностическим инструментом, который позволяет врачу не только точно определить тип инфекционного возбудителя в организме пациента, но и выявить количество патогенов. Эта помогает обнаруживать хронические инфекции, например, вирусный гепатит. Отличие ПЦР-диагностики от других методик лабораторных исследований заключается в следующем: Метод направлен на идентификацию самого возбудителя. Диагностика универсальна и может использоваться для выявления нескольких патогенов. Для точной диагностики достаточно только одного биологического образца пациента. Метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями. Для анализа подходит любой биологический материал пациента: возможно изучение мазка, мочи, спермы и т. Если говорить о других преимуществах методики, то можно отметить следующее: Специфичность. Поставить диагноз на основании полимеразной цепной реакции можно через 48 часов после сдачи биологического материала, что дает возможность своевременно начать лечение.
Далее, в ходе инфекционного процесса, к первым присоединяются антитела типа А. В более запущенных стадиях заболевания, вырабатываются иммуноглобулины G. Обнаружение при помощи иммуноферментной реакции иммуноглобулинов конкретного типа, позволяет определить, на какой стадии находится патология. Особенно в случаях получения сомнительных результатов, когда симптомы свидетельствуют об одном, а лабораторное исследование о противоположном. Постановить окончательный диагноз могут помочь дополнительные исследования, такие как иммуноблотинг для иммуноферментного анализа. Отличия ИФА и ПЦР диагностических методов: Иммуноферментный анализ позволяет установить лишь факт контакта организма с возбудителем инфекции. В то время как при помощи полимеразной цепной реакции возможно определить какой именно возбудитель проник в организм. Благодаря ИФА, реально подтвердить или опровергнуть факт распространенности инфекционного процесса в любом участке организма. Метод ПЦР же предназначен для обнаружения возбудителя только в исследуемом образце, то есть биологических жидкостях, фрагментах органов и тканей, которые были предоставлены для исследования. Для проведения иммуноферментного анализа пригоден абсолютно любой материал для исследования кровь, моча, слюна, частички органов и тканей. Потому как иммуноглобулины при ответе организма на проникновение возбудителя могут находиться где угодно. Для исследования путем полимеразной цепной реакции берется тот биологический материал, где предположительно может присутствовать возбудитель.
Внутренние контроли — несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке. ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера около 30 нуклеотидов , комплементарные специфическим ампликонам продуктам реакции. Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу. Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами. Ход реакции Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1]. Денатурация — процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур. Отжиг — процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются. Элонгация синтез. Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются: ПЦР с «горячим» стартом hot-start PCR — суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров. ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования. Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности. Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3].
История открытия современных методов молекулярной диагностики
Эта методика позволяет не только выявить ДНК возбудителя туберкулеза, но и те его мутации, которые указывают на устойчивость к препаратам противотуберкулезного ряда. Одним из передовых методов ПЦР является метод гибридизации на стрипах, который позволяет провести определение микобактерий и их устойчивость к противотуберкулезным препаратам". Актуальность проведения ПЦР-исследования на туберкулез прежде всего в том, что данная методика позволяет выявлять микобактерии у пациентов без бактериовыделения. Благодаря данной методике диагностировать туберкулез и назначать правильные схемы лечения учитывая устойчивость к определенным препаратам стало значительно легче.
В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции праймеры и нуклеотиды. При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК. ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК. Конкретные части генов обычно экзоны быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров. Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов.
Мы разберемся, как выявить перенесенный ковид в прошлом и оценить устойчивость иммунитета к нему. Лабораторные тесты на коронавирус Covid-19 Сегодня используются разные методы диагностики коронавирусной инфекции. Одни анализы можно сдать только в лаборатории, другие — самостоятельно даже не придется вызывать врача на дом, достаточно купить специальные наборы в аптеке : ПЦР-тест. Тест на антиген. Метод экспресс-диагностики, выявляющий присутствие в биоматериале специфических белков вируса. Выявление вируса через анализ крови.
Тест на антитела к коронавирусу. Первые четыре метода имеют идентичную задачу. Отличаются они сложностью проведения, затрачиваемым временем, точностью. Пятый их заменить не может. Она может делаться только в лабораторных условиях, поскольку требует изучения молекулярной структуры ДНК. Суть процедуры сводится к следующему: Берется мазок из носоглотки человека для большей точности это должен сделать медицинский работник.
Выделяется интересующий участок ДНК биоматериала. Осуществляется амплификация многократное удвоение этого участка до объема, оптимального для визуализации. Изучаются визуализированные фрагменты. Если при копировании участка ДНК в нем продолжает появляться вирус, значит, пациент заражен. Получить результаты ПЦР-теста можно через несколько дней. Во время ожидания особенно при наличии симптомов лучше соблюдать самоизоляцию.
Сегодня это наиболее достоверный диагностический метод. Риск получения ошибочного результата Вероятность получения ложноположительного результата невелика. Вирус может попасть в биоматериал пациента извне при условии нарушения санитарных правил. Поэтому проходить обследование лучше в надежных лабораториях, где подобное исключено.
Анализ соскоба из уретры или влагалища в гинекологии позволяет определить: - количество лейкоцитов их повышение говорит об инфекции, но у здоровых женщин небольшое число лейкоцитов присутствует во флоре ; - количество эритроцитов основной показатель воспалительного процесса при повышенном количестве ; -состав флоры у женщин он зависит от менструального цикла, но активность клеток говорит о нарушении микрофлоры ; - наличие трихомонады, гонококков, грибка — основная цель для выявления возбудителя инфекций; - наличие лактобацилл их отсутствие говорит о нарушенной микрофлоре. Также мазок определяет степень чистоты влагалища женщины: 1 и 2 степень — характерна для здоровой флоры, а 3 и 4 — выявляет кольпит, воспаление.
Преимущества данного метода состоят в простоте, доступности и быстроте получения результатов 30 - 60 мин и менее. Однако чувствительность данного метода ограничена около 105 бактерий в 1 мл. Практически не определяются в урогенитальном мазке вирусы, хламидии, микоплазмы и уреаплазмы, и одних только результатов мазка часто бывает недостаточно для постановки диагноза. Результаты мазка обычно можно использовать как ориентировочные. Перед сдачей мазка лучше воздержаться от мочеиспускания. Бактериологический метод бакпосев Бакпосев — метод диагностики ЗППП путем выращивания микробов в благоприятной для этого среде.
Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
Как проводится ПЦР-диагностика, когда назначают исследование с помощью этого метода и как подготовиться к анализу. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи.
Суть метода ПЦР
- ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
- ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
- ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
- ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови.
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
Нельзя ПЦР или ИФА-диагностикой заменить все существующие методы исследования. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – современный метод исследования, основанный на увеличении малых концентраций фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Характеристика метода ПЦР. Исследование при помощи полимеразной цепной реакции относится к количественным анализам. Анализ методом ПЦР – это диагностический метод, позволяющий выявить наличие возбудителя заболевания в организме даже, если он присутствует в минимальных количествах. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это прямой метод выявления возбудителя, то есть с помощью него можно определить РНК вируса со слизистой ротоглотки или носоглотки, то есть можно определить сам коронавирус.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Вызывает массу осложнений и дискомфортных ощущений. ПЦР тест назначается в качестве верифицируемого, подтверждающего догадки метода, исследуется параллельно с данными анамнеза, визуальной оценки, симптоматики. Хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз и прочие венерические инфекции. На ранних стадиях патологического процесса есть риск не заметить симптомы. Но именно этот момент — лучший для терапии. Поскольку дальше начинаются необратимые изменения в органах и системах. Болезнь не удается взять под контроль, обеспечить продолжительную жизнь пациенту также невозможно.
ПЦР назначается для раннего выявления патологического процесса. Генетические аномалии Любого типа. Потому методика представляет такую ценность для диагностики наследственных аномалий. Способ не до конца освоен, потому считается перспективным. Как уже было сказано, с помощью методики можно установить отцовство. Используется отдельная модификация анализа.
Подготовка к исследованию Меры зависят от того, какой биоматериал будут брать. Вот некоторые варианты: Моча Изучение урины требуется, когда проводят диагностику мочеполовых инфекций, поражений венерического плана у мужчин и женщин. У первых методика применяется не всегда. Часто ее заменяют забором соскоба из уретры. Перед проведением обследования, накануне запрещена гигиена репродуктивных органов. Анализ сдают в течение суток с момента подозрительного полового акта.
Но это не строгое требование, а скорее рекомендация по раннему выявлению патологического процесса. Кровь Также ее отдельные компоненты: сыворотка и пр. Забирают для определения гепатитов разных форм, дифференциальной диагностики патологий печени, выявления герпеса, СПИДа, также при обследовании на предмет генетических аномалий. Особых правил подготовки в этом случае нет. Кровь сдают натощак, это единственное требование к пациенту. Мокрота Отделяемое слизистой оболочки дыхательных путей.
Исследуется для диагностики респираторных патологий, пневмонии, бронхита, определения источника процесса. Также в рамках выявления других поражений: будь то легочные формы микоплазмоза или прочие. Специальная подготовка не требуется. Биоптат Биологический материал слизистой оболочки пищевода и желудка. Используется для диагностики причин язвы, гастрита и прочих патологий этой области. Например, таким способом удается надежно обнаружить хеликобактер, который чаще всего и оказывается виновником патологических процессов.
Подготовки опять же не нужно. Соскобы со слизистых оболочек Используются особенно часто. В основном, в рамках выявления венерических заболеваний, коронавируса. Но не только.
Если отслеживаете показатели в динамике, сдавайте каждый анализ при одинаковых условиях: в том же лабораторном отделении, тем же методом. Исследования для оценки эффективности лечения, как правило, проводят через 2—4 недели после приёма антибактериальных препаратов. Подготовка к ПЦР-анализу слюны За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами. За 3 часа до исследования рекомендуется отказаться от курения, употребления пищи и гигиены полости рта полоскание, чистка зубов, применение освежителей для рта, употребление леденцов, жевательной резинки. Подготовка к ПЦР-анализу мокроты За 2 недели до исследования по согласованию с лечащим врачом следует прекратить приём противомикробных препаратов и иммуномодуляторов. Мокроту следует собирать утром, сразу после пробуждения. Предварительно нужно почистить зубы и прополоскать рот, нельзя есть до взятия биоматериала. Важно собирать не слюну или носоглоточную слизь, а мокроту. Сделайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать «мокрый» кашель. Необходимо откашлять содержимое глубоких дыхательных путей. Сплюньте мокроту в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Минимальный объём мокроты — 1 мл. Доставьте контейнер в лабораторное отделение в день взятия биоматериала.
В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза. В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления, т. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Клонирование ДНК Молекулярное клонирование - это совокупность экспериментальных методов в молекулярной биологии, которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организме хозяина. Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух различных организмов: вид, который является источником ДНК, подлежащей клонированию, и вид, который будет служить в качестве живого хозяина для репликации рекомбинантной ДНК. Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части а их сшивать с произвольными молекулами ДНК , разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома например, определенный ген. В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину по сравнению со всей ДНК клетки. Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет такой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве. Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было упрощенно рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Клонирование определяется как процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий с использованием организмов здесь репликация. Основной подход предполагает использование бысто делящихся организмов чаще всего бактериальных клеток, обычно E. В нашем разделе о клонировании ДНК рассмотрим клонирование с использованием клеток бактерий E. Процесс самой ПЦР полимеразной цепной реакции , как метод амплификаци нуклеиновых кислот in vitro рассмотрим отдельно Прим. Плазмида кодирует гены, регулирующие репликацию и контролирующие копийность 1—2 молекулы на клетку. Искусственные бактериальные хромосомы часто используются для секвенирования геномов организмов в различных проектах, например в проекте Геном человека. Короткий фрагмент ДНК исследуемого организма вставляется в хромосому, а затем амплифицируется и секвенируется. После этого прочитанные последовательности выравниваются in silico в результате чего получается полная последовательность генома организма. Сейчас такой подход был вытеснен более быстрыми и менее трудоёмкими методами секвенирования, например методом дробовика или методами секвенирования нового поколения. На рисунке - этапы BAC-клонирования фрагмента ДНК с использованием вектора плазмиды , содержащего ген lac Z изображены этапы до выделения плазмид с клонированным фрагментом рис. Этапы клонирования фрагмента ДНК с ипользованием кишечной палочки и вектора, содержащего ген lac Z все этапы см. Если вектор, содержащий такой ген, ввести в клетку E. Исходные мутантные клетки, не содержащие b-галактозидазу, не способны к этому превращению. Следовательно, на среде с X-Gal исходные нерекомбинантные клетки будут давать белые колонии, а рекомбинантные клетки - голубые. Процесс клонирования ДНК включает следующие этапы: Получение целевых фрагментов ДНК в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции ; Выбор вектора Вектор - молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом хромосомой. Вставка фрагмента ДНК в вектор; Введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина и трансформация с помощью вектора организма хозяина то есть поглощение бактериальной клеткой молекулы ДНК из внешней среды ; Отбор успешно трансформированной клетки обычно отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости ; Размножение отобранной клетки Выделение векторных молекул из клетки Выделение целевого фрагмента ДНК. Изображение этапов клонирования Рис. Схема клонирования участка ДНК гена в бактериях Поскольку при каждом клеточном делении бактерии как и другие клетки удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду небольшую относительно бактериальной хромосомы - кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы. У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся « горизонтально » между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам именно из-за этого свойства их и открыли или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации последовательность, с которой начинается репликация молекулы , целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику. Плазмидная карта может быть прочитана путем понимания ее особенностей, таких как название и размер плазмиды, тип элементов в плазмиде и их относительное положение, а также ориентация промотора. В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды риc. После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости а, следовательно, и плазмиду. Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК или используют плазмиду целиком. Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок. На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, как были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК, то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном или заметную его часть. Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации. Сначала необходимо было выделить белок нужного гена. После чего отсеквенировать его фрагмент, обратить генетический код и получить последовательность нуклеотидов. В соответствии с ней химически синтезировали короткую молекулу ДНК которую, и использовали в качестве зонда для гибридизации. Стратегии ПЦР-клонирования Рис. Клонирование продуктов ПЦР. Клонирование ПЦР-продуктов ампликонов Традиционное клонирование основано на методах рекомбинантных ДНК, которые начинаются с подготовки вектора для получения ДНК-вставки путем расщепления каждого из них ферментами рестрикции. Затем расщепленные фрагменты сращиваются вместе ферментом, называемым лигаза, в процессе, известном как лигирование, с образованием нового вектора, способного экспрессировать интересующий ген. ПЦР-клонирование - это метод, при котором двухцепочечные фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР , лигируются непосредственно в вектор. ПЦР-клонирование предлагает некоторые преимущества по сравнению с традиционным клонированием, которое основано на расщеплении двухцепочечных вставок ДНК с помощью ферментов рестрикции рестриктазами для создания совместимых концов, очистки и выделения достаточных количеств и лигирования в аналогично обработанный вектор. ПЦР-клонирование - это метод клонирования, который значительно сокращает время и усилия, затрачиваемые на реакцию клонирования. Процедура клонирования ПЦР состоит из четырех следующих этапов: 1 Получение фрагмента гена с помощью ПЦР, 2 расщепление геномной ДНК , 3 лигирование в плазмидный вектор и 4 трансформация в бактерии, а затем бактерии будут реплицировать плазмиду. При ПЦР-амплификации этот метод клонирования требует гораздо меньше исходных шаблонных материалов, которые включают кДНК, геномную ДНК или другую плазмиду, несущую вставку. Кроме того, клонирование ПЦР обеспечивает более простой рабочий процесс, обходя требование о наличии подходящих сайтов рестрикции и их совместимости между вектором и вставкой. Тем не менее, существует ряд соображений, касающихся: праймеров для ПЦР и условий амплификации, выбора метода клонирования и используемых векторов клонирования и, наконец, подтверждения успешного клонирования и трансформации. Что касается ПЦР-амплификации интересующей последовательности, необходимо разработать праймеры и оптимизировать условия ПЦР компоненты и циклы для эффективной и специфической амплификации матрицы шаблона. Инструменты для конструирования праймеров доступны для биоинформационной оценки и выбора подходящих специфичных для мишени целевых последовательностей праймеров для амплификации. Для оптимизации ПЦР важны также концентрации компонентов реакции, температуры отжига и количество шаблонов. ТА-клонирование и клонирование по тупым концам Рис.
Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа. Метод обладает высочайшей чувствительностью — мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя. Несомненное преимущество метода — оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день. При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с так называемым «человеческим фактором». ПЦР — очень высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание». Оценивать результаты реакции должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ теста означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР — результат окажется положительным. Другой вариант — это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин — материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
Принципы ПЦР-диагностики
Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4]. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — это точный метод лабораторной диагностики, который используют для выявления возбудителей инфекционных заболеваний. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydia trachomatis.
ПЦР-диагностика: суть подхода
- Принцип метода ПЦР (полимеразная цепная рекация), часть 1 (д.б.н. Ю.М. Романова) - YouTube
- Похожие статьи
- ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови.
- ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
- Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?
- Что такое анализ ПЦР и как его проводят